本書首先介紹CRISPR/Cas系統(tǒng)的起源和基本原理，在此基礎上詳細介紹CRISPR/Cas技術與病原體檢測、CRISPR/Cas技術與耐藥檢測、CRISPR/Cas技術與腫瘤檢測、CRISPR/Cas技術與非傳染病原體檢測、CRISPR/Cas技術與小分子檢測，CRISPR/Cas技術與新冠病毒突變株檢測以及CRISPR/Cas現(xiàn)存的技術瓶頸及可能的解決方案等。作為一本涵蓋CRISPR理論和應用技術的工具書，將全面反映CRISPR/Cas技術的國內(nèi)外最新進展；并詳細介紹相關技術操作細節(jié)和方法，力求使零基礎讀者能借此獨立開展實驗設計和操作，并取得預期實驗結果，促進新技術推廣和產(chǎn)業(yè)化。
作為一本涵蓋CRISPR理論和應用技術的工具書，將全面反映CRISPR/Cas技術的國內(nèi)外最新進展；并詳細介紹相關技術操作細節(jié)和方法，力求使零基礎讀者能借此獨立開展實驗設計和操作，并取得預期實驗結果，促進新技術推廣和產(chǎn)業(yè)化。
CRISPR/Cas 技術的創(chuàng)新發(fā)展推動生命科學研究進入了劃時代的新階段。CRISPR/Cas 基因編輯技術用于腫瘤和遺傳病等難以治愈疾病的治療，創(chuàng)建了基因治療新方法。法國科學家卡彭蒂耶和美國科學家杜徳娜在CRISPR/Cas 研究與應用領域做出了杰出貢獻，被授予2020 年諾貝爾化學獎。
CRISPR/Cas 技術在分子診斷領域展現(xiàn)了巨大潛力，是繼聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR）技術之后，備受關注的又一個里程碑，已廣泛應用于感染性和非感染性疾病的篩查與診斷。2018 年，Science 雜志將CRISPR/Cas 分子診斷技術稱為新一代分子診斷方法。2022 年，Nature 雜志將CRISPR/Cas 分子診斷技術列為當年最值得關注的七項技術之一。
為了適應國際前沿技術發(fā)展，積極普及生物診斷新知識、推廣新技術，促進產(chǎn)業(yè)化快速發(fā)展，中國醫(yī)藥生物技術協(xié)會生物診斷技術分會在時任主任委員李銀太教授的主持下，組織相關專家歷經(jīng)兩年多時間編寫了《CRISPR 分子診斷技術原理及應用》一書。全書分上、中、下三篇，系統(tǒng)介紹了CRISPR 分子診斷技術原理、技術方法及在生物診斷領域應用的最新進展。此外還介紹了一種具備核酸內(nèi)切酶活性的Argonaute 核酸酶及其在分子診斷中的應用。
本書既注重描述CRISPR 相關技術基本原理，又比較詳細介紹了實驗方法及設計理念，并提供了系列分子診斷實例，期望能為讀者提供具有參考價值的理論知識和操作指南。由于該前沿技術發(fā)展日新月異，新方法和新應用不斷涌現(xiàn)，難免掛一漏萬，敬請讀者諒解。
在此，謹代表中國醫(yī)藥生物技術協(xié)會生物診斷技術分會，對所有為本書編輯問世做出貢獻的專家和同道表示衷心感謝！
中國醫(yī)藥生物技術協(xié)會生物診斷技術分會主任委員
李越希
2024 年10 月于南京
專業(yè)技術少將主任醫(yī)師，享受國務院特殊津貼。江蘇省醫(yī)藥生物技術重點實驗室主任、南京市生物（基因）醫(yī)藥工程技術中心主任，負責的醫(yī)藥生物技術研究所為國家博士后科研工作站。國家863疫苗項目總體組專家，江蘇省醫(yī)學領軍人才，江蘇省重點學科帶頭人，全軍醫(yī)藥生物技術學科帶頭人。中國藥科大學、南京醫(yī)科大學、徐州醫(yī)科大學博士生導師。
緒論/1
一、CRISPR/Cas系統(tǒng)的發(fā)現(xiàn)/1
二、CRISPR/Cas系統(tǒng)的組成與分類/2
三、CRISPR/Cas系統(tǒng)在分子診斷中的應用/3
四、CRISPR分子診斷技術的研究熱點及發(fā)展方向/4
上篇CRISPR分子診斷技術
第一章CRISPR/Cas蛋白作用原理與應用/8
第一節(jié)CRISPR/Cas蛋白分類與功能/8
一、1類CRISPR/Cas蛋白/9
二、2類CRISPR/Cas蛋白/10
第二節(jié)CRISPR分子診斷技術應用/15
一、CRISPR分子診斷技術工作原理/15
二、CRISPR分子診斷體系/18
第二章CRISPR技術與核酸現(xiàn)場快速檢測/27
第一節(jié)智能手機CRISPR技術/27
一、技術原理/27
二、技術方法/29
第二節(jié)基于環(huán)介導恒溫擴增/側向流層析的CRISPR技術/31
一、技術原理/31
二、技術方法/31
第三節(jié)基于重組酶聚合酶恒溫擴增/側向流層析的CRISPR技術/32
一、技術原理/32
二、技術方法/33
第四節(jié)可穿戴的CRISPR診斷裝備/34
一、技術原理/34
二、技術方法/35
第五節(jié)CRISPR分子診斷一體機快檢系統(tǒng)/36
一、SmartRanger一體機/36
二、BG-Nova-X8一體機/37
第三章CRISPR多重檢測技術/40
第一節(jié)單管多重CRISPR分子檢測/40
一、單管四重CRISPR分子檢測/40
二、單管雙重CRISPR分子檢測/41
三、恒溫擴增聯(lián)合CRISPR分子雙重檢測/42
第二節(jié)多反應容器多重CRISPR分子檢測/43
一、基于并聯(lián)反應管的多重CRISPR分子檢測/43
二、微流控多重CRISPR分子檢測平臺/44
三、紙基微流控多重CRISPR分子檢測/44
四、全自動多重CRISPR分子檢測/45
五、CARMEN微流控CRISPR分子檢測平臺/45
第四章免核酸擴增CRISPR分子診斷/48
第一節(jié)免核酸擴增檢測技術/48
一、Cas9免核酸擴增檢測/48
二、Cas12免核酸擴增檢測/51
三、Cas13免核酸擴增檢測/54
四、多重CRISPR/Cas系統(tǒng)級聯(lián)法檢測/59
第二節(jié)免核酸擴增CRISPR分子診斷技術的應用/61
一、液滴微流控定量檢測方法/61
二、多條crRNA聯(lián)合檢測/63
三、基于納米金探針的免核酸擴增檢測/65
第五章CRISPR分子診斷系統(tǒng)信號輸出/69
第一節(jié)檢測信號輸出方式/69
一、光學信號/69
二、電化學信號/73
三、側向流層析試紙條顯色/74
四、其他信號輸出方式/74
第二節(jié)CRISPR分子信標系統(tǒng)/75
第六章CRISPR非核酸靶標檢測技術/84
第一節(jié)離子檢測/85
第二節(jié)小分子化合物檢測/87
一、ATP檢測/87
二、抗生素檢測/90
三、代謝物檢測/90
四、三聚氰胺檢測/91
五、毒物檢測/91
第三節(jié)多糖檢測/91
第四節(jié)蛋白質檢測/92
一、多肽檢測/92
二、蛋白標志物檢測/94
三、干擾素檢測/96
四、蛋白酶檢測/96
五、酶活性檢測/97
第五節(jié)細胞檢測/98
第六節(jié)轉錄因子檢測/100
中篇CRISPR分子診斷技術應用
第七章病原微生物檢測/106
第一節(jié)李斯特菌檢測/107
一、技術原理/107
二、技術方法/108
第二節(jié)結核分枝桿菌檢測/109
一、技術原理/109
二、技術方法/110
第三節(jié)炭疽桿菌檢測/111
一、技術原理/111
二、技術方法/112
第四節(jié)煙曲霉檢測/114
一、技術原理/114
二、技術方法/114
第八章病毒變異檢測與分型/116
第一節(jié)SARS-CoV-2變異株檢測/116
一、SARS-CoV-2變異株/116
二、基于CRISPR/Cas技術的SARS-CoV-2變異株檢測/119
三、重組酶輔助擴增#NAME?快速檢測SARS-CoV-2Omicron
變異體/127
第二節(jié)寨卡病毒檢測及分型/134
一、寨卡病毒制備與處理/135
二、NASBA反應/135
三、NASBACC反應/135
第九章特殊病原體檢測/139
第一節(jié)支原體檢測/139
一、肺炎支原體檢測/139
二、人型支原體檢測/140
第二節(jié)螺旋體檢測/142
第三節(jié)諾卡菌檢測/143
一、鼻疽諾卡菌檢測/143
二、蓋爾森基興諾卡菌檢測/144
第十章腫瘤診斷/147
第一節(jié)DNA點突變檢測/147
一、依賴PAM的單核苷酸差異檢測/147
二、不依賴PAM的罕見點突變檢測/148
第二節(jié)DNA甲基化檢測/150
一、技術原理/151
二、技術方法/151
第三節(jié)腫瘤微小RNA檢測/152
一、基于Cas9的微小RNA檢測/152
二、基于Cas12a的微小RNA檢測/153
第四節(jié)腫瘤蛋白標志物檢測/154
一、技術原理/155
二、技術方法/155
第十一章非感染性疾病診斷/158
第一節(jié)CRISPR檢測趨化因子配體mRNA/158
一、技術原理/158
二、技術方法/159
第二節(jié)CRISPR-FISH檢測線粒體DNA突變/159
一、技術原理/159
二、技術方法/160
第三節(jié)CRISPR-層析技術檢測DNA缺失突變/164
一、技術原理/164
二、技術方法/164
第四節(jié)CRISPR-酶聯(lián)免疫吸附試驗/165
一、技術原理/165
二、技術方法/166
第五節(jié)CPISPR-鏈置換擴增檢測/167
一、技術原理/167
二、技術方法/169
第六節(jié)CRISPR-適配體傳感器/171
一、技術原理/171
二、技術方法/171
第十二章耐藥基因檢測/176
第一節(jié)-內(nèi)酰胺類耐藥基因檢測/176
一、技術原理/176
二、技術方法/177
三、技術特點/178
第二節(jié)氨基糖苷類耐藥基因檢測/179
一、技術原理/179
二、技術方法/180
三、技術特點/180
第三節(jié)乙型肝炎病毒拉米夫定耐藥基因檢測/181
一、技術原理/181
二、技術方法/182
三、技術特點/183
第四節(jié)流行性感冒病毒奧司他韋耐藥基因檢測/183
一、技術原理/183
二、技術方法/184
三、技術特點/185
第五節(jié)瘧原蟲磺胺多辛耐藥基因檢測/185
一、技術原理/185
二、技術方法/186
三、技術特點/187
第六節(jié)肺癌靶向藥物表皮生長因子受體耐藥基因檢測/188
一、技術原理/188
二、技術方法/189
三、技術特點/190
第七節(jié)急性髓系白血病靶向藥物FLT3耐藥基因檢測/190
一、技術原理/190
二、技術方法/191
三、技術特點/192
第十三章食品安全檢測/195
第一節(jié)核酸靶標檢測/195
一、CRISPR-光熱可視化雙模式檢測/206
二、CRISPR-G四聯(lián)體耦合技術的智能手機檢測/208
三、CRISPR-表面增強拉曼散射微流控檢測/211
四、CRISPR-表面增強拉曼散射可視化檢測/213
五、CRISPR快速鑒別清真食品/215
第二節(jié)非核酸靶標檢測/217
一、CRISPR-適配體傳感器檢測ATP/221
二、CRISPR-上轉發(fā)光生物傳感器/222
三、CRISPR-納米鏈級聯(lián)熒光適配傳感器/224
下篇Argonaute分子診斷系統(tǒng)
第十四章Argonaute核酸酶/232
第一節(jié)Ago分類系統(tǒng)/232
一、Ago分子進化/232
二、Ago結構特征/233
第二節(jié)Ago催化活性與生物學功能/236
一、核酸酶活性/236
二、生物學功能/236
第三節(jié)Ago催化機制/238
一、依賴引導鏈剪切/238
二、不依賴引導鏈剪切/239
三、堿基錯配對剪切的影響/239
四、引導鏈的5端修飾對剪切的影響/240
第四節(jié)Ago基因編輯與核酸檢測/240
一、Ago基因編輯/240
二、Ago核酸檢測/241
三、Ago成像技術/249
第十五章Ago檢測腫瘤及遺傳病低豐度基因/254
第一節(jié)技術原理/255
第二節(jié)技術方法/255
第三節(jié)技術特點/260
第十六章Ago檢測病原體核酸/262
第一節(jié)技術原理/262
第二節(jié)技術方法/264
第三節(jié)技術特點/270
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